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为了贯通落实《乡村振兴战略规划(2018-2022年)》《全国畜禽遗传资源保护和利用“十三五”规划》，切实加强我国地方猪遗传资源保护，有效对付非洲猪瘟疫情的严重威胁，2019年6月22-23日，农业农村部种业管理司组织地方猪遗传材料采集保存工作相关科研工作者召开会议，通报《国家级地方猪遗传材料采集保存工作实施方案》。云南农业大学魏红江教授受邀参加，并作了题为“家畜成纤维细胞制作和体细胞克隆技术在保种上的应用”的学术报告。 会议通报《国家级地方猪遗传材料采集保存工作实施方案》(农种畜函[2019]14号)，拟采集制作61个国家级保种场、保护区内国家级地方猪精液、体细胞等遗传材料，并建成国家级地方猪遗传材料信息数据库。云南农业大学与江西农业大学猪遗传改良与养殖技术国家重点实验室将协助全国畜牧总立制定遗传材料采集技术规范，并进行技术指导。魏红江教授的科研团队发明性地把体细胞克隆技术应用到了地方家畜品种的种质资源保护上，曾冻存来自云南、内蒙古、西藏等地区的家畜地方品种耳组织成纤维细胞，并通过对濒于灭绝的生存于乌蒙山一带的乌金猪黄毛系个体，利用体细胞克隆技术进行地方家畜品种的保存。目前，超细型绒山羊、乌金猪黄毛系、乌骨绵羊的克隆个体均已繁殖出后代。上述主意可服务于我国地方猪遗传材料保存工作，为地方家畜品种种质资源的保护与利用提供理论和技术支撑。 农业农村部种业管理司关于印发《国家级地方猪遗传材料采集保存工作实施方案》的通知 农种畜函〔2019〕14号 各省、自治区、直辖市农业农村(农牧)、畜牧兽医厅(委、局)，新疆生产建设兵团农业农村局、黑龙江省农垦总局，各有关单位: 为贯通落实《乡村振兴战略规划(2018-2022年)》《全国畜禽遗传资源保护和利用“十三五”规划》，切实加强我国地方猪遗传资源保护，有效对付非洲猪瘟疫情的严重威胁，农业农村部种业管理司决心开展国家级地方猪遗传材料采集保存工作。现将《国家级地方猪遗传材料采集保存工作实施方案》印发你们，请按照方案请求，详细抓好相关任务措施落实。如有不可抗力等有关情况，及时向我司畜禽种业处、全国畜牧总立反馈。 联系人及电话： 种业管理司畜禽种业处 周晓鹏 010—59193287 全国畜牧总立畜禽资源处 张桂香 010—59194625 农业农村部种业管理司 2019年6月17日 国家级地方猪遗传材料采集保存工作实施方案 为贯通落实《乡村振兴战略规划(2018-2022年)》《全国畜禽遗传资源保护和利用“十三五”规划》，有效对付非洲猪瘟疫情对地方猪遗传资源的严重威胁，加快国家级地方猪品种遗传材料采集和保存，提高地方猪遗传资源保护能力，维护地方猪遗传资源的系统性和尽整性，制定本方案。 一、目的意义 我国地方猪遗传资源具有抗逆性强、耐粗饲、繁殖率高、肉质优良等特性，利用地方猪遗传材料开展育种工作，有利于提高生猪种业竞争力，发展特色畜牧业，满意城乡居民多样化、高品质消费需求。当前非洲猪瘟防控形势重杂严重，对地方猪遗传资源安全造成重要威胁。采用超低温寒冻技术，采集保存我国地方猪品种的DNA、精液、体细胞及肠道菌群等遗传材料，是对付非洲猪瘟疫情威胁，丰富地方猪品种保护手段，尽善家畜遗传资源保种体系，推动生猪种业健康可持续发展的重要途径。 二、主要任务 (一)采集制作遗传材料 采集制作61个国家级保种场、保护区内国家级地方猪精液、体细胞等遗传材料(见附件1)。每个地方猪品种收集不少于120份耳组织样(>2克/份);每个品种制作寒冻精液不少于15000剂(0.25mL细管)或者7500剂(0.5mL细管);每个品种制作体细胞系不少于222份(每份1mL)：每个品种收集不少于120份健康后备猪清新粪便样品。 (二)构建国家级地方猪遗传材料信息数据库 在采集遗传材料的同时，收集供体出生日期、三代以内系谱信息、性能测定等表型记录数据，构建国家级地方猪遗传材料信息数据库。 三、任务分工 (一)全国畜牧总立。具体组织项目实施，制定遗传材料采集制作和验收标准，在江西农业大学、云南农业大学等单位协助下开展技术培训，进行督导检查与验收，集中保存遗传材料，收集汇总记录档案。指导中国农业大学构建采集遗传材料信息数据库，做好数据库运行和维护等工作。 (二)保种场(保护区)。协助开展遗传材料采集和制作，和病毒、细菌检测等工作，协助提供供体三代以内系谱(需签字盖章)、生产性能测定等数据和正面、侧面数码照片各1张。 (三)遗传材料制作单位。江西农业大学、云南农业大学等遗传材料采集制作单位，与全国畜牧总立签订安全和保密允诺书，采集制作遗传材料并开展病毒、细菌等检测(见附件2、3)，提供检测报告或者相关证明材料，填报相关数据(见附件4、5、6、7)，按期将制作产品输送至国家级家畜基因库保存。 江西农业大学猪遗传改良与养殖技术国家重点实验室和云南农业大学协助全国畜牧总立制定遗传材料采集技术规范，进行技术指导，备份采集的遗传材料，定期向全国畜牧总立书面汇报工作发展。 四、进度调度 1月至6月中旬：制定实施方案，明确参加遗传材料采集单位的任务，与有关单位签订购买服务合同。 6月下旬：举办国家级地方猪遗传材料采集制作培训班，全面启动相关工作。 6月下旬至12月：开展遗传材料采集制作及入库保存工作。对各制作单位收集制作遗传材料进行质量抽查。 12月底：各遗传材料制作单位提交项目执行情况等总结报告。 五、保障措施 (一)加强组织领导。农业农村部种业管理司尽职总体统筹协调，省级农业农村主管部门踊跃协调配合本辖区内工作。全国畜牧总立牵头组织实施，省级畜牧技术推广机构、遗传材料制作单位和国家级地方猪保种场(保护区)、地县农业农村部门、各级种业管理系统等通力协作、密切配合，确保高效尽成工作。 (二)规范开展工作。加强对制作单位和保种场(保护区)的培训指导，强化项目参加人员、遗传材料、数据信息等管理，保证遗传材料质量与生物安全。明确所收集遗传材料的所有权、使用权等，相关专项成绩等按照国家法律法规及相关规定实现共享。 (三)严厉经费使用管理。承担单位应加强项目经费管理，建立健全内审机制，专款专用，明确经费预算、使用范围，严厉按照预算支出。项目组织实施单位会同地方主管部门，定期不定期对项目单位的资金使用情况、执行进度等进行督导，保障项目规范有序实施。 附件： 1.任务分工表 2.国家级地方猪遗传材料制作及质量检测方案 3.疫病检测清单 4.遗传材料采集供体登记表 5.精液采集和制作记录表 6.体细胞制作记录表 7.国家级家畜基因库样品采集记录表 附件2 国家级地方猪遗传材料制作及质量检测方案 一、精液寒冻保存 (一)数量请求 每个保种场(保护区)的每个品种保存寒冻精液不少于15000剂(0.25mL细管)或7500剂(0.5mL细管)，公猪不少于6头，涵盖所有家系，每个个体保存寒冻精液不少于800剂(0.25mL)或400剂(0.5mL)。 (二)供体请求 符合品种特性、特征;三代以内无血缘关系，系谱清晰;健康、必检疾病为阴性。 (三)细管标记及包装 应在细管上标明保种场(保护区)建设单位代码、品种代码、供体号和生产日期。保种场(保护区)建设单位代码用汉语拼音大写首字母表示，品种代码为该品种汉字的汉语拼音大写首字母，生产日期按年月日次序罗列，年月日各占二位数字，年度的后两位数组成年的二位数，月、日不够二位的，月、日前分辞加“0”补充为二位数。 CQXK为重庆畜牧科学院代码，RCZ为荣昌猪的品种代码，11003为该公猪号，120525为2012年5月25日的生产日期。 细管装入指形管，指形管上标记供体猪号、寒冻精液数量及生产日期。再用灭菌纱布袋将装有寒冻精液的指形管包装起来，一个灭菌纱布袋装一头猪的寒冻精液，并有标签附在纱布袋上，放入液氮中保存。纱布袋标签请求标记如下内容：袋号、品种、供体猪号、寒冻精液数量、解冻后精子的活力。 (四)质量检测 1. 抽样数量及请求 抽取总样本量的2%进行质量检测，检测合格率请求达到80%以上。 2. 指标 (1)0.25mL剂型寒冻精液 每支剂量≥0.18mL;活力≥30%;精子畸形率≤20%;每支前进运动精子数≥2.5×107;每支细菌菌落数≤800个。 (2)0.5mL剂型寒冻精液 每支剂量≥0.40mL;活力≥30%;精子畸形率≤20%;每支前进运动精子数≥5.0×107;每支细菌菌落数≤1600个。 二、体细胞寒冻保存 (一)数量请求 每个保种场(保护区)的每个品种公猪不少于12头，涵盖所有家系;母猪不少于25头，每个个体体外培育原代或第1代细胞6管，每管1mL，用1.5mL或2.0mL冻存管包装，细胞密度为1×105/mL以上。 (二)供体请求 符合品种特性、特征;三代以内无血缘关系，系谱清晰;健康、必检疾病为阴性。 (三)寒冻管标记及包装 冻存管上标记编号、品种汉语名称或代码，细胞名称或代码、性辞、培育代数、冻存日期。用灭菌纱布袋将冻存管包装起来，一个灭菌纱布袋装2-3头猪的冻存管，并有标签附在纱布袋上，放入液氮中保存。纱布袋标签标伎捶种、供体猪号、冻存管数量。 (四)质量检测 1.抽样数量。抽取总样本量的4%进行质量检测，检测合格率请求达到70%以上。 2.指标。细胞密度不低于1×105个/mL;细胞活力80%以上;支原体检测为阴性。 三、耳组织及基因组DNA样寒冻保存 每个保种场(保护区)每个品种采样数量40头(对所有公猪家系所有进行采样，繁殖公猪、繁殖母猪各1头，和后备公猪和后备母猪各1头，且后备猪避免全同胞关系)。每个品种每个个体采集3份耳样，每份耳组织样不少于2克(用2 ml冻存管保存)，冻存管上详细标注品种、耳号、性辞、采样日期、场地等关键信息。耳样采集后立即置于液氮中保存。 四、肠道菌群寒冻保存 (一)数量请求 每个保种场(保护区)每个品种公猪不少于10头，母猪不少于50头，每头猪采集粪便样本2份(每份2克)。 (二)供体请求 60日龄后备猪，符合品种特性、特征;三代以内无血缘关系，系谱清晰;近一个月没有使用抗生素、食欲正常、体重达该品种60日龄阶段标准。 (三)冻存管标记及包装 冻存管上标记编号、品种汉语名称、性辞、采样日龄、采样日期。 (四)采样请求和主意 1.采样请求 (1)每头猪采集清新粪便样本2份(每份2克)，其中一份用2.0 mL冻存管包装后立即投入液氮或-80℃保存，另一份用5.0mL冻存管取1克清新粪便置于3.0 mL 含20%甘油和5%蔗糖的保护液中，液氮或-80℃保存。 (2)采样用冻存管请求无菌，配置的含20%甘油和5%蔗糖的保护液无菌。 (3)从肛门采集清新粪便样品，采样时每头猪要更改新的手套，防止交织污染。 2.粪便样品采集和保存主意 (1)采样前准备。①2 mL和5 mL冻存管高压灭菌(或直接购买无菌冻存管);②配置75%乙醇;③寒冻保护液配置：以配置100mL保护液为例：无菌生理盐水中加入20 mL甘油和5g蔗糖，混匀、定容到100 mL。④液氮或干冰;⑤另外耗材：一次性手套、纸巾等。 (2)样品采集。①固定采样猪，用纸巾和75%乙醇擦洗肛门;②换上一次性手套，从肛门采集粪便样品;③从采集的粪便头中，取中间部分粪便2克装入2 mL冻存管，擦拭洁净冻存管，在管壁标记耳号、性辞、采样如期和年龄，立即投入液氮中;④另取中间部分粪便1克装入放有3 mL保护液的冻存管中，混匀，在管壁标记耳号、性辞、采样如期和年龄，投入液氮中。⑤在液氮中保存，或送至实验室后转移到-80℃。⑥样品运输邮寄可用干冰。
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